Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг

1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.

Рассмотрим более подробно методы выделения и идентифи-

кации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для

использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником

этих фрагментов являются искусственным образом сконструиро-

ванные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или

скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в

зависимости от специфических особенностей этих последова-

тельностей. Библиотека генов это полный набор клонированных

перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате

рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выде-

ленной из какого-либо специфического источника. В зависи-

мости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые

библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек ис-

пользуют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из от-

дельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК

-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или куль-

тивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-

ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом об-

ратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её

разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.

Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-

тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиоте-

ках присутствуют не только кодирующие последовательности ге-

нов, но также несмысловые внутригенные последовательности -

интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-

рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки

состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. На-

иболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со сред-

ним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч

пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрываю-

щихся последовательностей геномной ДНК человека получается

после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или

Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть ко-

личество клонов с различными инсертированными фрагментами

ДНК, определяется размерами исходного генома и необходи-

мостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в

одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные

библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 -

10!6 различных клонов.

Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или

космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче

хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библи-

отек генов человека особенно удобны векторы, полученные на

основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая

способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много

удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут

быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векто-

ры не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто

используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-

ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не

вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для

создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,

используется технология искусственных дрожжевых хромосом

-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)

фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-

нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-

ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных

ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или

космидных библиотеках.

Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на

фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными

ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека

сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).

Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают

на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-

зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-

зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.

Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие

чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры

и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят

их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-

ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-

тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-

тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на

рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-

зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК

последовательности, комплементарные зонду, или специфические

антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных

культурах производят именно в тех местах, где произошло по-

темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,

отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-

нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и

субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать

большие количества этой ДНК.