Кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от

условий проведения электрофореза (напряжение, температура

буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-

честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК

используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной

массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих

специфические последовательности, также может быть осущест-

влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и

идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из

геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-

роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с

целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В

последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-

ментов ДНК широко используется метод клонирования в

искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения

библиотек генов на основе YAC-векторов.

Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки

по хромосоме, идентификация и изоляция генов.

Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют

около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.

4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов

и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар

нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых

с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-

ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых

минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-

довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-

вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-

ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-

тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-

ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно

содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят

упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-

ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-

ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-

фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее

мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых

можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-

ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-

ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это

насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-

фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-

вания различными методами инсертированных в них фрагментов

ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-

ванными в заданном районе. Значительно чаще используется

тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,

сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-

варительно отобранных на основании сцепления с различными

ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных

сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск

в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые

последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими

методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по

хромосоме.

"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование

(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-

держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-

ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе

проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-

ленной с геном. После нахождения положительных клонов

последние сами служат зондами для изоляции других клонов,

содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об-

разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест-

ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре-

зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол-

ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных

клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-

тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно

установить степень перекрывания между соседними фрагментами

и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".

При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого

нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-

ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо-

бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном

направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно

клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса

поиска генных последовательностей американским исследовате-

лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че-

ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот

метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено-

ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),

не изолируя при этом все промежуточные последовательности

ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной

схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то

есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с

геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива-

ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются

большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж-

ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за

счет искусственного присоединения к их концам небольшого

маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов

сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими

рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов

ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следова-

тельно, и окружающие его концевые участки исходных крупных

фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаго-

вых или космидных векторах, получая библиотеку генов конце-

вых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг кло-

нов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах компле-

ментарные зонду последовательности соединены маркерным геном

с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка

поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег-

менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме-

тода скользящего зондирования.

Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно

отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых

других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;

Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,

1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три

группы. В первой группе исследуют структурные особенности

генных последовательностей. Вторая группа критериев основана

на поиске функциональных участков генов. В третьем случае

анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести-

руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге-

нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым

скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг-

ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),

промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,

а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в

них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов

может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных

фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео-

тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую-

щими в базах данных идентифицированными генами других видов

живых существ.

Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,

представленные в геноме уникальными последовательностями,

достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует

высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми

генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,

так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова-

тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную

гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи-

вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,

птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова-

тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в

инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру-

ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге-

нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на-

личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).

Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть

осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей

нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони-

рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова-

ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).

Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК

гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в

тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой

целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум

критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих

тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио-

теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным

первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из

пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь-

ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою

очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления

всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К

сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза-

ция может не дать положительных результатов.

Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите-

риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,

являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность

выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован-

ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные

доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК

специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе-

ны, например, при определении нуклеотидной последователь-

ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова-

тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа-

тельством в пользу правильности проведенной идентификации

гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в

изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих

соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,

при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони-

руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная

мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша-

ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв-

ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция

первичного биохимического дефекта, выполненная на соот-

ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой-

кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био-

логических моделей данного наследственного заболевания.

Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге-

номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта

оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз-

мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию

гена, так как позволяет определить его границы в геномной

ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре-

гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова-

тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино-

кислотную последовательность соответствующего белка и таким

образом определить первичное биохимическое звено в патогене-

зе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических

основ наследственных заболеваний получил название обратной

генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от

белка к гену, так называемого функционального клонирования,

был назван позиционным клонированием, тем более, что термин

обратной генетики уже использовался ранее для обозначения

метода анализа функции гена путем направленного введения в

него мутаций (Collins, 1992).

Возможность использования функционального клонирования

зависит от доступности информации о белковом продукте и/или

о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль-

шинства моногенных болезней определение первичного биохими-

ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу

из-за недостаточного понимания функционирования огромного

числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,

низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе-

ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о

клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи-

мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных

о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности

генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их

сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно-

го клонирования в идентификации генов, ответственных за

наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе-

зусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возмож-

ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется

уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8

представлена общая схема позиционного клонирования, за-

имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для

нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления

используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения

хромосомной принадлежности картируемого гена более

точная локализациия может быть установлена с помощью при-

цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде-

ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп-

ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель-

но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически

видимой структурной перестройки в области локализации этого

гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци-

енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно-

го такого случая может исключить необходимость картирования

гена путем последовательного анализа его сцепления с генети-

ческими маркерами целого генома и позволит перейти не-

посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об-

разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,

миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-

рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных

болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли-

тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод

"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож-

дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов

и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование

методами гибридизации in situ большого количества анонимных

кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи-

ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель-

ному увеличению степени насыщенности различных сегментов

хромосом известными генными последовательностями, среди ко-

торых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в

этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим

линиям животных, моделирующим различные наследственные забо-

левания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нук-

леотидных последовательностей кодирующих участков гомологич-

ных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа

консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов

позволяют успешно вести параллельные исследования геномов

человека и других животных, значительно ускоряющие эффектив-

ность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов

человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).

Молекулярная идентификация генов открывает широкие

возможности для анализа тканеспецифической регуляции их

экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от

транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного

анализа является генотипирование мутаций и исследование тех

нарушений в структуре, локализации или в ферментативной ак-

тивности соответствующих белков, которые возникают в резуль-

тате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти

проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.

Отметим только, что в настоящее время подобные исследования

стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний

человека, для которых идентифицированы геномные последова-

тельности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол-

норазмерные кДНК-последовательности.

Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.

Международная программа "Геном человека".

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации

о генетических картах хромосом человека, локализации и функ-

циях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят

исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в

Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством

профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований

является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между

последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содер-

жащих сводные данные о всех картированных генах человека и

связанных с ними наследственных болезнях под названием:

"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих

генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in

man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive,

and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные

хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обоб-

щенные в виде отдельных статей сведения о характере наследо-

вания, функциях и размерах генов; методах их картирования и

идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, по-

лиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявле-

ниях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а

также о природе основного дефекта, включая патогенез и пато-

физиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими

литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным ло-

кусам с различным типом наследования и по генам наследствен-

ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хро-

мосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названи-

ям генов или по наименованиям соответствующих генных болез-

ней. Отдельно представлены данные по клонированным генам,

для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом

количество различных идентифицированных мутантных вариантов

для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.

Издания содержат также список доступных мутантных клеточных

линий.

Каждому локализованному менделирующему локусу в этой

энциклопедии присвоен шестизначный номер (MIM), первая цифра

которого определяет характер наследования: 1 - для аутосом-

но-доминантных генов, 2 - для аутосомно-рецессивных, 3 и 4-

для генов, локализованных в X- и в Y-хромосомах, соот-

ветственно, 5 - для митохондриальных генов. Четыре цифры,

следующие после точки непосредственно за шестизначным номе-

ром, предназначены для кодирования различных мутантных вари-

антов данного локуса. Издания выпускаются как в печатной

форме, так и в компьютерном варианте (OMIM) на дискетах или

на компакт-дисках. В последнем случае они снабжены програм-

мами, позволяющими осуществлять поиск по любой позиции и

проводить постоянное обновление энциклопедии текущей инфор-

мацией. Программы OMIM совместимы с другими базами генети-

ческих данных, в первую очередь, с GDB (Genome Data Base),

содержащей полную информацию (включая последовательности

ДНК) обо всех картированных генах, ДНК-маркерах и ДНК-зондах

человека, а также и с GenBank - полной базой данных всех из-

вестных нуклеотидных gоследовательностей ДНК.

В последнем 11-ом издании энциклопедии МакКьюсика со-

держатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах

человека (McKusick, 1994). Из них 4458 генов с аутосомно-до-

минантным характером наследования, 1730 - с аутосомно-ре-

цессивным, 412 генов локализовано в X-хромосоме, 19 - в

Y-хромосоме и 59 - в митохондриальной ДНК. Для более чем

2800 картированных генов определена их функция. С моногенны-

ми заболеваниями связано 770 картированных локусов, а общее

число нозологических форм, для которых гены картированы,

включает 933 заболевания. При этом более 420 генов

наследственных болезней уже клонированы и для каждого из

этих генов описано от одного до нескольких сотен мутантных

вариантов аллелей, характеризующихся различным фенотипи-

ческим проявлением.

Различные хромосомы и их участки картированы с разной

степенью детализации. На самой крупной по размерам хромосоме

1 картировано вдвое меньше генов, чем на Х-хромосоме ( 200 и

400 соответственно). Плотность уже картированных генов в

разных хромосомах очень неравномерна. Так, хромосома 19 со-

держит 178 генов, тогда как хромосома 13 только 40, при этом

первая больше второй. Хромосомы 17 и 18 примерно равны по

величине, но на первой уже картировано 180 генов, а на вто-

рой- только 26. На хромосоме 2 картировано примерно такое же

количество генов (около 175), как и на втрое меньше её по

размерам хромосоме 17. Существеные различия в числе картиро-

ванных генов отмечаются и внутри различных участков хро-

мосом. К примеру, 19 из 43 генов хромосомы 21 локализованы в

сегменте 21q22.3, составляющем лишь 20% длинного плеча. Об-

ласть 9q34 занимает 10% хромосомы 9, но содержит 27% генов -